琼脂糖凝胶电泳实验过程？
琼脂糖凝胶电泳实验流程详解与注意事项
实验步骤：
-
电泳方法选择 进行一般的核酸检测时，琼脂糖凝胶电泳即可胜任，若需高分辨率电泳，特别是DNA片段间仅有几个碱基对的差异，则应选择聚丙烯酰胺凝胶电泳，对于巨大的DNA链,脉冲凝胶电泳是更合适的选择。
-
凝胶浓度的设定 琼脂糖凝胶电泳的浓度通常在0.5%至2%之间，低浓度适用于大片段核酸的电泳，而高浓度则用于小片段的分析，为避免低浓度胶易碎的问题,需小心操作并使用质量上乘的琼脂糖。
-
缓冲液的选择 常用的缓冲液包括TAE和TBE，其中TBE具有更佳的缓冲能力,使用新鲜制备的缓冲液能明显提升电泳效果。
-
电压与温度的控制 电泳时的电场强度不应超过20V/cm，而电泳温度应维持在低于30℃的水平，对于巨大的DNA电泳，温度甚至需要降至15℃以下。
-
DNA样品准备 注意样品中的盐分和杂质蛋白含量，因为高盐分和杂质蛋白可能导致条带模糊或缺失，通过乙醇沉淀可以去除多余的盐分,而使用酚则可以去除蛋白。
-
DNA上样量的把控 正确的上样量是确保条带清晰的关键，过多的DNA可能导致条带模糊,而DNA量过少则可能导致信号弱或条带缺失。
-
DNA Marker的选择与应用 进行DNA电泳时，必须使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估算DNA片段大小，选择与目标片段大小相近、ladder较密的Marker能更准确地估计片段大小。
-
凝胶染色与观察 实验室常用的核酸染色剂为溴化乙锭（EB），虽然其染色效果好且操作方便，但稳定性差且具毒性，观察凝胶时，需根据染料类型选择合适的光源和激发波长,以确保条带清晰可见。
注意事项：
- 巨大的DNA链在普通电泳中可能无法完全跑出胶孔,导致缺带现象。
- 高浓度的胶可能会使分子大小相近的DNA带难以分辨,造成条带缺失。
- 多次使用的电泳缓冲液会导致离子强度降低和pH值上升，从而影响缓冲性能,可能导致DNA条带模糊和不规的迁移。
- 过高的电泳电压和温度同样可能导致DNA条带模糊和不规的迁移,特别是电压过大时小片段可能跑出胶外造成缺带。
- DNA样品若发生变性，可能导致条带模糊、缺失或不规则迁移，为防止变性，上样前不要对DNA样品进行加热，并可使用20mM NaCl缓冲液进行稀释。
- 严格控制DNA的上样量，避免过多或过少,以确保电泳结果的准确性。
遵循以上步骤和注意事项,将有助于您更准确地完成琼脂糖凝胶电泳实验。